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行業新聞

2019-06-13基于分子對接技術石菖蒲中抗抑郁活性成分的篩選

抑郁癥是一種病理機制尚不明確的精神障礙性疾病,已成為當代社會威脅人們健康的重要疾病。目前臨床上使用的抗抑郁藥主要是基于“單胺神經遞質假說”而研發的單靶點藥物,包括選擇性5-羥色胺(5-HT)再攝取抑制劑、選擇性去甲腎上腺素(NA)再攝取抑制劑、選擇性NA/5-HT再攝取抑制劑、單胺氧化酶抑制劑(MAOI)及5-HT受體激動劑等[1]。但這些藥物有效率較低、不良反應多,停藥后易復發,從而限制了其在臨床上的廣泛應用[1]。隨著中醫藥的發展,中藥或中藥單體為治療抑郁癥帶來了新的方向。

石菖蒲為天南星科多年生草本植物石菖蒲Acorus tatarinowii Schott的干燥根莖,具有開竅豁痰、醒神益智功效,臨床上主要用于神經系統疾病的治療[2]。石菖蒲是抗抑郁中藥復方使用頻次較多的藥物之一,石菖蒲單味藥的不同提取部位均能抗小鼠抑郁和焦慮行為[3],但石菖蒲抗抑郁作用的物質基礎和作用機制尚不明確。本研究采用分子對接技術,以單胺氧化酶AMAO-A)、多巴胺轉運體(DAT)、5-羥色胺轉運體(SERT)和組胺H1受體(H1R)為作用靶點,研究石菖蒲抗抑郁的物質基礎和作用機制,為其進一步開發利用提供參考。

1  材料與方法

1.1  配體庫的建立

采用傳統中藥藥理數據庫(TCMSPhttp://lsp.nwu.edu.cn/tcmspsearch.php?)建立石菖蒲口服易吸收化合物庫[4]。以石菖蒲為關鍵詞檢索到105個化合物,利用口服生物利用度(OB)≥30%進行二次篩選[5],得到65個化合物(包括 Beta-細辛醚、Alpha-細辛醚),占到總化合物的61.90%。用ChemBio 3D繪制候選化合物(配體)的三維結構,并使用MM2力場進行構象優化,將處理完畢的小分子保存為Mol2的格式,最后使用AutoDock toolsADT)保存為PDBQT的格式備用。

1.2  受體蛋白的準備

抑郁癥相關藥物靶點參考治療靶蛋白數據庫(therapeutic target database TTDhttp://bidd.nus. edu.sg/group/cjttd/),結合文獻報道[6-8],選取與抑郁癥相關的4個靶點蛋白作為受體蛋白,分別為代謝多巴胺(DA)、5-HTNAMAO-A;與DA攝取、轉運有關的DAT;與5-HT攝取、轉運相關的SERT;以及與鎮靜、抗焦慮有關的H1R。靶點蛋白結構全部來自于RCSB蛋白數據庫(http://www.rcsb.org/),靶點代號(PDB ID)以及其蛋白結合的原配體見表1,用ADT對原PDB文件進行下列處理:(1)去除溶劑分子(即水分子);(2)去除配體分子;(3)蛋白分子加極性氫。

1.3  對接參數的設置以及驗證

采用的分子對接軟件為斯克利普斯研究所Olson課題組開發的AutoDockVina,進行半柔性分子對接計算。AutoDockVina采用復雜的梯度優化算法來加快局域極小化的過程,并采用了多線程技,相比AutoDock 4在速度上提升了約2個數量級且精度更好[9]。半柔性對接指的是對接中小分子配體的構象是柔性,可以發生改變,而受體蛋白則是剛性,不發生變化。以靶點蛋白原配體作為中心設置格點,設置的中心坐標以及盒子大小見表2

使用Chimera[10]軟件將靶點蛋白的原配體的構象抽取出來,保存為PDB的格式,并用ADT處理為 PDBQT的格式備用。然后利用Autodock Vina將原配體對接回去,選取能量最低的構象與原配體計算均方根偏差(RMSD)、親和力(Ki)以衡量參數設置的合理性。利用軟件VMD計算RMSDKi根據以下公式計算,Kiexp[(ΔG×1 000)/(Rcal×T)]其中ΔG單位為kcal/molT298 KRcal1.987 19 cal/(mol?K)。根據最低對接能、RMSDKi衡量參數設置是否合理。對接參數以及結果見表2

以上靶點蛋白的原配體均能成功對接到靶點蛋白的活性中心上,RMSD均小于0.20 nm,并且其Ki分別為416.4954.9016.8365.00 nmol/L,與文獻報道[11-14]的生物活性處于同一數量級,表明對接參數設置合理。

1.4  石菖蒲的化學成分與靶點蛋白的分子對接及其篩選標準

分別用處理好的候選化合物與上述4個靶點使用AutoDockVina進行對接,并計算Ki。根據候選化合物和陽性藥的整體對接結果,避免高得分(親和力)化合物的屏蔽作用,減少假陰性化合物的產生,將每個靶點的親和力排名前10%(前7位)的化合物(如有親和力相同的化合物則并列)認定為陽性結果[15]。利用PymolLigplot分析和觀察化合物與蛋白的對接結果[16-17]

2  結果

2.1  石菖蒲中化學成分與4個靶點蛋白的作用情況

通過使用AutoDockVina對石菖蒲中OB30%65種化合物和4個靶點蛋白進行對接,發現了18種潛在活性化合物,結果見表3。能夠同時作用4個靶點的為異紫花前胡內酯、山柰酚、2″-O-甲基異甘草苷元、8-異戊烯基山柰酚。能同時作用2個靶點的有佛手柑內酯、橙花叔醇、環阿屯醇。其余11種化合物能與1個靶點發生相互作用。因此石菖蒲中多成分可能通過抑制DA等神經遞質的代謝、減少DA5-HT的攝取和抑制H1R的活性等發揮抗抑郁作用。

2.2  潛在活性化合物與各靶點的親和力氫鍵作用以及疏水作用

18種候選化合物與4個靶點的對接結果見表47。與MAO-A有較強親和力化合物有7種,而且9-氨基吖啶、異紫花前胡內酯、山柰酚、2″-O-甲基異甘草苷元4種化合物的作用強于原配體肉葉蕓香堿(去氫駱駝蓬堿,harmine);與DAT有較強親和力的化合物有10種,環阿屯醇、8-異戊烯基山柰酚的親和力作用超過原配體去甲替林;與H1R有較強親和力的化合物有9種;與SERT有較強親和力的化合物有7種,其中環阿屯醇、8-異戊烯基山柰酚、山柰酚與靶點蛋白的親和力大于或等于陽性藥S-西酞普蘭。

9-氨基吖啶是一種含氮原子的雜環化合物,經過TCMSP數據庫查閱是石菖蒲中獨特含有的一種化合物,它與MAO-A的親和力很強,其可能是石菖蒲抗抑郁的主要物質基礎。環阿屯醇是植物甾醇類化合物,具有抗炎、抗腫瘤、抗氧化、抗菌、抗阿爾茨海默病等多種活性[18]。本研究中,首次發現環阿屯醇與DATSERT具有很強的親和力,因此環阿屯醇有可能開發成具有抗抑郁活性的中藥單體或先導化合物,或推進含環阿屯醇的中藥應用于抗抑郁。 

選取與每個靶點蛋白親和力最高的化合物,做出化合物與蛋白結合圖,可直觀觀察活性化合物與靶點的結合模式以及與周圍氨基酸殘基的相互作用,結果見圖1

9-氨基吖啶占據了由殘基Ile180Asn181Gln215Ile335Leu337Met350Tyr407Tyr444Fad600形成的活性空腔,其氨基與Asn181形成一個氫鍵,其環狀結構與Tyr407形成π-π堆積作用。Upadhyay[19]研究結果表明,能否與Phe208Asn181Tyr407相互作用,是決定化合物能否與MAO-A活性中心結合的關鍵,這與本研究對接結果相符。另外,原配體肉葉蕓香堿與Tyr407也存在一個π-π堆積作用,這表明Tyr407是化合物能否與MAO-A結合的一個關鍵殘基。

DAT的活性空腔組成除Ser421Ser422外均為疏水殘基,而環阿屯醇為僅具有1個羥基的三萜類結構,即疏水作用是環阿屯醇與DAT結合的主要推動作用。Penmatsa[20]研究表明,與氨基酸殘基Phe43Val120相互作用是抗抑郁活性的關鍵,這進一步驗證了本研究結果的的可靠性。

山柰酚的371號的氧原子與Ser111Thr194Tyr431形成氫鍵,其環狀結構與Tyr108Trp428Phe432Phe435Ile454存在疏水作用,且與Tyr431Phe432存在T型的π-π堆積作用。Heifetz[21]研究結果也表明,化合物與氨基酸殘基Asp107Tyr108Ser111Thr112Asn198Phe199Trp428Tyr431Phe432Tyr458H1R與化合物作用的關鍵殘基。

SERT的活性空腔主要由Tyr95Ile172Ala173Tyr176Phe335Gly338Phe341Val343Gly338Ser439Glu493組成,環阿屯醇很好地占據了SERT的活性空腔,且與Tyr95Ile172Tyr176Phe335Phe341存在較好的疏水作用,這可能是其較好得分的原因。Henry[22]的定點突變實驗表明,Tyr95Ile172SERT的關鍵殘基,與本研究結果相一致。

3  討論

本研究共篩選出石菖蒲的18種化合物與抗抑郁作用的靶點蛋白有相互作用,其中黃酮類3種、香豆素類2種、甾醇類1種、揮發油類9種、木脂素類1種、其他類2種,揮發油類占多數,這與石菖蒲的藥理作用的主要物質基礎是揮發油相一致[23-24]但將石菖蒲主要揮發油成分β-細辛醚進行分子對接,發現其抑制單胺氧化酶和單胺類轉運體的作用較差,表明β-細辛醚可能通過其他機制發揮抗抑郁作用,如顯著抑制大鼠腦皮質神經細胞和海馬神經細胞凋亡[25]

本研究中有4種化合物能同時作用于上述4個靶點,分別為異紫花前胡內酯、山柰酚、2″-O-甲基異甘草苷元和8-異戊烯基山柰酚,后3種為黃酮類化合物。已有文獻報道黃酮類化合物具有抗抑郁的活性[26],王佳等[27]通過實驗驗證了山柰酚具有抗大鼠抑郁的作用,能提高抑郁癥大鼠腦內NADA5-HT的水平,與本研究虛擬篩選結果一致。8-異戊烯基山柰酚的脂溶性比山柰酚大,更有利于透過血腦屏障,有利于其發揮抗抑郁的效果,有待后續的藥理實驗驗證。異紫花前胡內酯為香豆素類化合物,本研究發現其具備較強抗抑郁的潛在活性。香豆素類化合物是一類廣泛存在于藥用植物的活性物質,其具有廣泛的藥理活性,如抗病毒、抗炎、抗腫瘤[28];但香豆素抗抑郁作用鮮見文獻報道,本研究為香豆素類化合物開發為抗抑郁藥物提供了理論導向。

已有一些石菖蒲抗抑郁作用及作用機制的實驗報道。吳全娥等[29]研究表明尖葉假龍膽配伍石菖蒲能顯著提高大鼠腦內5-HT的水平;周天等[30]研究結果表明,石菖蒲提取物及其低極性部位能顯著改善抑郁模型小鼠的抑郁癥狀,并且能顯著升高小鼠腦內5-HTACTH;劉梅等[31]研究結果表明,含有石菖蒲的藜歡解郁膠囊,能顯著增加抑郁小鼠血清NADA5-HT的含量發揮抗抑郁的作用;以上實驗結果可以佐證本研究虛擬篩選的作用靶點選擇合理。

本研究中石菖蒲的18種活性化合物中有9種與H1R有較好的親和力,抗焦慮抑郁藥多慮平與H1R的親和力高于一般抗組胺藥,但石菖蒲抗抑郁的作用是否與其抗組胺作用有關還需要進一步研究。

本研究通過分子對接技術篩選出18種石菖蒲中的抗抑郁的活性成分,其中與靶點蛋白作用活性較強的化合物有3種,分別為9-氨基吖啶、山柰酚和環阿屯醇。這些化合物的抗抑郁活性有待于進一步生物實驗驗證。

參考文獻(略) 

來  源:劉永杰,向慧龍,陳  浩,徐凌云. 基于分子對接技術石菖蒲中抗抑郁活性成分的篩選 [J]. 中草藥, 2019, 50(11):2612-2619.

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